Диско-дифузійний метод
На поверхню щільного живильного середовища, засіяного суцільним газоном досліджуваної культурою, накладають не більше 6 дисків, просочених антибіотиками, на відстані не менше 2 см один від одного. Реєстрація результатів проводиться через 18-24 години інкубування в термостаті за діаметром зони відсутності зростання навколо дисків з антибіотиками. Наявність зростання навколо диска свідчить про нечутливість даного мікроба до антибіотика. Для інтерпретації результатів використовують спеціальні таблиці.
Рисунок 1. Визначення чутливості
мікроорганізмів диско-дифузійним методом:
1 – мікроорганізм чутливийдо антибіотика;
2 – мікроорганізм помірно резистентнийдо антибіотика;
3 – мікроорганізм стійкийдо антибіотика.
Метод Е-тестів
Принцип способу. Визначення чутливості мікроорганізму проводиться аналогічно до тестування диско-дифузійним методом. Відмінність полягає в тому, що замість диска з антибіотиком використовують смужку Е-тесту, що містить градієнт концентрацій антибіотика від максимальної до мінімальної. У місці перетину еліпсовидної зони пригнічення росту зі смужкою Е-тесту набувають значення мінімальної переважної концентрації (МПК).
Рисунок 2. Визначення чутливості мікроорганізмів за допомогою Е-тестів
Метод серійних розведень у бульйонному середовищі
У пробірках, що містять 1 мл Мюллер-Хінтон бульйону, готують серійні дворазові розведення антибактеріального препарату, наприклад 100 мкг/мл – 1-а, 50 мкг/мл – 2-а, 25 мкг/мл – 3-я, 12,5 мкг /мл - 4-я і т.д. Потім кожну пробірку вносять 0,1 мл випробуваної бактеріальної суспензії. Одночасно ставлять контроль зростання (1 мл Мюллер-Хінтон бульйону та 0,1 мл суспензії бактерій). Посіви інкубують при 37°С протягом 18-24 годин, після чого відзначають результати. Відсутність помутніння середовища свідчить про затримку зростання бактерій у присутності концентрації препарату.
Рисунок 3. Визначення значення МПК методом розведення в рідкому живильному середовищі
Мінімальна переважна концентрація (МПК) – найменша концентрація антибіотика (мкг/мл або мг/л), яка in vitro повністю пригнічує видиме зростання бактерій.
2 Визначення чутливості різних штамів стафілококів до антибіотиків методом стандартних дисків
|
Антибіотик |
Зона придушення росту, мм |
Характеристика штаму |
Досліджувана культура є чутливою до __________________________________________________
помірно стійкою до _________________________________________________________________________,
стійкою до _________________________________________________________________________________.
3 Визначення мінімальної переважної концентрації (МПК) пеніциліну методом серійних розведень.
Висновок:МПК пеніциліну для досліджуваного штаму становить _____________________________________
Переваги способу:____________________________________________________________________________
Недоліки методу:____________________________________________________________________________
4 Виявлення та реєстрація антагоністичної дії різних видівбактерій.
На чашку з МПА штрихом діаметром засівається мікроб-антагоніст і перпендикулярно до нього тест-штами. Облік результатів проводиться через добу після посіву. Наявність та ступінь антагоністичної дії визначають за величиною зон затримки зростання тест-культур.
Штриховий посів________________________
Висновок:найбільшу антагоністичну дію виявлено до тест-штамів (вкажіть види) _____________________________________________________________________________________________________________
ЗАНЯТТЯ № 8
ТЕМА:ПІДСУМКОВЕ ЗАНЯТТЯ ЗА ТЕМОЮ: «ІСТОРИЧНІ ЕТАПИ РОЗВИТКУ МІКРОБІОЛОГІЇ, МОРФОЛОГІЯ, ФІЗІОЛОГІЯ І ГЕНЕТИКА МІКРООРГАНІЗМІВ».
Форми та розміри справжніх бактерій. Характеристика кулястих, паличкоподібних та звивистих форм істинних бактерій.
Структура мікробів. Основні відмінності прокаріотних клітин від еукаріотів.
Клітинна стінка грампозитивних та грамнегативних бактерій.
Типи мікроскопічних препаратів. Техніка виготовлення фіксованих препаратів.
Техніка мікроскопії у світловому мікроскопі. Вивчення морфології мікроорганізмів у електронному мікроскопі.
Тинкторіальні властивості бактерій. Барвники. Прості методи фарбування фіксованих препаратів.
Принципи класифікації патогенних прокаріотів (Берджі, 2001).
Захисні пристрої у мікроорганізмів. Спори, стадії та умови утворення спор, біологічне значення.
Капсули бактерій, їх значення.
Джгутики, їхня будова. Вії. Секс-пили.
Складні способи фарбування. Техніка фарбування за Грамом, Цилем-Нельсеном, Буррі-Гінсом, Нейссером.
Методи дослідження мікроорганізмів у стані. Кон-тест. Принцип способу.
Спірохети. Систематичне становище та морфологія спірохет. Особливості ультраструктури та хімічного складу. Методи дослідження.
Актиноміцети, морфологія, ультраструктура, хімічний склад. Патогенні види. Роль актиноміцетів у природі та медицині. Методи виявлення.
Таксономія хламідій. Морфологія, структура, методи виявлення. Цикл розвитку хламідій.
Ріккетсії, морфологія, ультраструктура, хімічний склад. Патогенні види.
Мікоплазми. Класифікація. Філогенез. Способи виявлення.
Дефектні форми мікробів: протопласти, сферопласти, L-форми.
Живлення бактерій. Поживні речовини – джерела вуглецю та азоту. Класифікація бактерій за типами харчування Аутотрофи та хемоорганотрофи
Чинники зростання та його джерела. Джерела мінеральних елементів.
Способи та механізми перенесення поживних речовин через мембрану.
Енергетичні потреби бактерій. Шляхи одержання енергії у аутотрофів (фотосинтез, хемосинтез). Джерела та шляхи отримання енергії у хемоорганотрофів.
Аеробний та анаеробний типи біологічного окиснення у бактерій. Аеробні, анаеробні, факультативно анаеробні та мікроаерофільні бактерії. Способи створення анаеробних умов.
Завдання, етапи, переваги та недоліки бактеріологічного (культурального) методу дослідження.
Зростання та розмноження мікроорганізмів. Способи розмноження. Бінарний (простий) розподіл, механізм. Розмноження бактеріальних популяцій.
Принципи та методи культивування бактерій. Поживні потреби бактерій.
Поживні середовища для культивування бактерій. Вимоги до живильних середовищ. Класифікація живильних середовищ.
Умови та техніка культивування бактерій. Техніка посіву на живильні середовища. Закономірності та характер зростання бактерій на щільних та рідких живильних середовищах.
Способи виділення чистих культур аеробних та анаеробних бактерій.
Властивості мікроорганізмів, які використовуються для ідентифікації виділених культур.
Ферменти бактерій, класифікація. Методи вивчення біохімічних властивостей мікроорганізмів. Практичне використання біохімічної активності в ідентифікації бактерій
Визначення сахаролітичних властивостей, склад середовищ Гісса; визначення протеолітичних властивостей, визначення каталазної та оксидазної активності.
Принцип роботи та особливості застосування приладів автоматичної ідентифікації бактеріальних культур (гемокультиватор, автоматичний аналізатор).
Особливості культивування рикетсій та хламідій.
Бактеріофаги (фаги). Історія відкриття. Морфологія, структурні особливості, хімічний склад та властивості фагів.
Вірулентні фаги. Фази взаємодії із бактеріальною клітиною. Результати взаємодії фага та клітини. Помірні фаги. Профаг. Явище лізогенії. Фагова конверсія.
Методи виділення та титрування бактеріофагів на щільних та рідких поживних середовищах. Застосування фагів у мікробіології та медицині. Фагодіагностика та фаготипування.
Спадковість. Організація генетичного апарату у бактерій (нуклеоїд, плазміди, Is-Послідовності, транспозони).
Принципи функціонування бактеріального геному. Організація оперону. Генотип та фенотип.
Плазміди, класифікація, структура та властивості плазмід. R-плазміда, особливості структури та функції. Плазміди бактеріоциногенії.
Мінливість бактерій. Модифікації у бактерій, значення, основні прояви та властивості (неспадковий характер, адаптивність, висока частота прямих та зворотних змін, безліч факторів, що індукують).
Генотипічна мінливість. Мутації та його класифікація. Мутаген. Фенотипові прояви мутацій. Доля мутантів. Дисоціація у бактерій. Вплив відбору. Система репарації ушкоджень геному.
Рекомбінаційна мінливість. Механізми утворення комбінованих геномів. Частота змін окремих ознак. Трансформація, трансдукція, кон'югація.
Практичне значення знання генетики мікробів. Принципи генетичного картування.
Методи генетичного аналізу (молекулярна гібридизація, полімеразна ланцюгова реакція, блотинг, секвенування).
Поняття про генну інженерію та використання її методів у мікробіології та біотехнології. Одержання та застосування генно-інженерних вакцин та цитокінів.
Протимікробні заходи. Вплив екологічних чинників мікроби. Дія фізичних факторів (температури, висушування, випромінювання, ультразвук, осмотичний тиск). Чинність хімічних факторів.
Цілі, способи, засоби та об'єкти стерилізації та дезінфекції у медичній та мікробіологічній практиці. Контроль якості дезинфекції. Контроль стерилізації та стерильності. Способи проведення.
Антисептика. Визначення. Антисептичні засоби, вимоги, походження, властивості, групи, механізми на мікроби. Типи антисептики. Терапевтична антисептика. Профілактична антисептика.
Хіміотерапевтичні препарати. Властивості. Основні групи хіміопрепаратів. Механізми на бактерії. Поняття про вибірковість та "мішені" дії.
Антибіотики. Визначення. Продуценти антибіотиків Синтетичні та напівсинтетичні антибіотики.
Основні групи антибіотиків із хімічної структури. Бета-лактамні антибіотики Тетрацикліни. Аміноглікозиди. Макроліди та азоліди. Анзаміцини (рифампіцини). Левоміцетин. Фторхінолонові антибіотики. Лінкоміцин. Поліміксини. Глікопептиди
Класифікація антибіотиків для механізму впливу на бактеріальну клітину.
Механізми стійкості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів.
Методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків та інших хіміопрепаратів. Техніка встановлення, обліку та оцінки чутливості методом дисків, Е-тесту, серійних розведень.
ЗАНЯТТЯ №9
ТЕМА:ЕКОЛОГІЯ БАКТЕРІЙ. ІНФЕКЦІЯ. ПАТОГЕННІ МІКРООРГАНІЗМИ. ТОКСИНИ МІКРОБІВ. БІОЛОГІЧНИЙ (ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИЙ) МЕТОД.
ПЕРЕЛІК КОНТРОЛЬНИХ ПИТАНЬ
Мікрофлора тіла людини . Нормальна (резидентна) мікрофлора людини. Аутохтонна та аллохтонна, пристінкова та просвітна мікрофлора. Формування та розвиток нормальної мікрофлори. Функції нормальної мікрофлори: протиінфекційна, метаболічна, імунобіологічна, антитоксична.
Дисмікробіоценоз (дисбактеріоз), причини, види, принципи корекції.
Концепція інфекції. Визначення, загальна характеристика. Відмінність інфекційних хвороб від неінфекційних.
Роль мікроорганізму у інфекційному процесі. Інфікуюча доза. Способи зараження. Вхідні ворота. Патогенність та вірулентність. Генетичний контроль патогенності та вірулентності. Чинники, що підвищують та знижують вірулентність мікробів.
Чинники патогенності. Методи визначення вірулентності, одиниці. Облігатно-патогенні та умовно-патогенні мікроорганізми.
Токсичність та токсигенність мікроорганізмів. Ендотоксини, властивості, одержання, застосування. Екзотоксини, властивості, одержання, одиниці виміру. Типи екзотоксинів, механізм дії.
Роль макроорганізму у розвитку та перебігу інфекційних хвороб. Спадкові фактори. Анатомо-фізіологічний стан організму. Роль умов життя у розвитку та перебігу інфекційних хвороб. природні фактори. соціальні фактори.
Класифікація інфекційних процесів за тяжкістю, характером збудника, за джерелом інфекції, способом передачі збудника та механізмом зараження, за поширеністю. Класифікація інфекційних процесів з локалізації мікробного вогнища, тривалості перебігу та кратності зараження.
Динаміка інфекційного процесу, його особливості.
Біологічний (експериментальний) метод дослідження, етапи, оцінка. лабораторні тварини. Способи зараження.
ЛАБОРАТОРНА РОБОТА
1 Вивчення нормальної мікрофлори.
А) Посів для вивчення нормальної мікрофлори шкіри рук на середовище Ендо та кров'яний агар методом реплік.
Принцип методу:стерильні шматочки фільтрувального паперу 1х1 см у чашці Петрі зволожити стерильним фіз. розчином. Стерильним пінцетом помістити шматочок паперу на досліджувану поверхню шкіри рук на 0,5 хв. Помістити папір на поверхню щільного живильного середовища (відбиток) на 1 хв. Папір видалити. Чашки з відбитками інкубувати при 37°С, 24-48 годин.
В) Провести облік посіву мікрофлори, приготувати препарати з різних типів колоній, пофарбувати за Грамом, мікроскопувати (у демонстраційних посівах).
Облік посіву мікрофлори:
Мікроскопія препаратів:
|
Препарат______________ _______________________ Забарвлення _______________ _______________________ |
Препарат______________ _______________________ Забарвлення _______________ _______________________ |
2 Оцінка адгезивностіE. coliза їх здатністю до адсорбції на поверхні еритроцитів
Принцип методу:До суспензії еритроцитів додають випробувану культуру мікроорганізмів. Після інкубації готують мазки, фарбують і під мікроскопом визначають середню кількість бактерій, що адсорбувалися на одному еритроциті.
Еритроцити в даному випадку використовуються як модель клітини сприйнятливого мікроорганізму.
3 Визначення ферментів інвазивності у стафілококів
1. Плазмокоагулаза
Принцип методу: У пробірку, що містить цитратну плазму кролика, вноситься випробувана культура. Після інкубації у термостаті враховується результат. При позитивному результаті плазма згортається (коагулює).
2.Фібринолізин
Принцип методу: У пробірку з фібрином (відмитий від еритроцитів потік крові) вносять випробувану культуру. Після інкубації у термостаті враховується результат. При позитивному результаті згусток розчиняється.
3.Гіалуронідаза
Принцип методу: У пробірку з гіалуроновою кислотою (ГЗК) вносять випробувану культуру. Після інкубації термостаті додають реактив, що викликає згортання ГУК і враховують результат. При позитивному результаті (внаслідок розщеплення ГУК) згустку не утворюється.
4.Лецитовітелаза (лецитиназа)
Принцип методу: виділені культури стафілококу засівають на жовтково-сольовий агар, який містить 7,5% хлориду натрію та жовткову суспензію. При позитивному результаті навколо колоній вірулентних стафілококів утворюється райдужний ореол внаслідок розщеплення лецитину, що міститься у жовтку курячого яйця.
Висновок: (перерахуйте ферменти вірулентності кожного з двох вивчених штамів) _____________________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________________
Бактеріальні токсини
Токсичність __________________________________________________________________________________
Токсигенність _________________________________________________________________________________
Ендотоксин ___________________________________________________________________________________
Ендотоксичний шок ___________________________________________________________________________
Практичне застосування ендотоксинів:
Екзотоксин ___________________________________________________________________________________
Анатоксин ____________________________________________________________________________________
Схема отримання екзотоксин та анатоксину.
1.____________________________________________________________________________________________
2.____________________________________________________________________________________________
4.____________________________________________________________________________________________
Практичне застосування анатоксинів:
1.____________________________________________________________________________________________
2.____________________________________________________________________________________________
3.____________________________________________________________________________________________
Etest® є смужкою з інертного пластику, на яку нанесений антимікробний препарат у концентрації, що змінюється по градієнту від мінімальної до максимальної, в діапазоні, еквівалентному 15 дворазовим розведенням. З іншого боку, на смужку нанесена шкала відповідних мінімальних інгібуючих концентрацій (МІК). Е-тести дозволяють визначати мінімальну інгібуючу концентрацію антимікробного препарату (кількісний дифузійний метод).
. Засійте чашку культурою мікроорганізму.
. Розмістіть смужки Etest® (до 2 на стандартну чашку діаметром 90 мм або до 6 на чашку діаметром 180 мм).
. У процесі культивування навколо смужки сформується еліпсоподібна зона інгібування росту, яка перетинає стрип у точці, що відповідає МІК.
. Е-тести використовуються понад 20 років.
. Понад 100 антимікробних препаратів.
. Стрипи виявлення полірезистентності.
. Визначення чутливості вибагливих мікроорганізмів, стрептококів, анаеробних мікроорганізмів, грибів (в т.ч. цвілевих), мікобактерій туберкульозу та ін.
. Зручна форма випуску: по 30 або 100 штук, у блістерній упаковці або в пінопластовому картриджі.
| номер за каталогом | |||||
| Індивідуальна упаковка |
Пінопластовий картридж (t° зберігання +20°С/+4°С) |
(t° зберігання -20°С) |
|||
| Найменування | 30 стрипів | 100 стрипів | 30 стрипів | 100 стрипів | 30 стрипів |
| Протигрибкові | |||||
| E-тест Амфотерицин | 526318 | 526310 | |||
| E-тест Анідулафунгін | 532008 | 532000 | |||
| E-тест Вориконазол | 532818 | 532810 | |||
| E-тест Ітраконазол | 412380 | 525818 | 525810 | ||
| E-тест Каспофунгін | 412269 | 532418 | 532410 | ||
| E-тест Кетоконазол | 525918 | 525910 | |||
| E-тест Мікафунгін | 535708 | 535700 | |||
| E-тест Позаконазол | 532118 | 532110 | |||
| E-тест Флюконазол | 412350 | 510818 | 510810 | ||
| E-тест Флюцітозин | 510918 | 510910 | |||
| Протитуберкульозні | |||||
| E-тест Ізоніазид | 527900 | ||||
| E-тест Етамбутол | 527700 | ||||
| E-тест Етіонамід | 527500 | ||||
| Протибактеріальні | |||||
| E-тест Азітроміцин | 412251 | 501618 | |||
| E-тест Азтреонам | 412259 | 501718 | 501710 | ||
| E-тест Амікацин | 412219 | 501318 | |||
| E-тест Амоксицилін | 412243 | 500918 | |||
| E-тест Амоксицилін/клавуланова кислота (2/1) | 412241 | 501018 | 501010 | ||
| Е-тест Ампіцилін | 412253 | 501518 | |||
| E-тест Ампіцилін/сульбактам (2/1) | 412251* | 501818 | 501810 | ||
| E-тест Бацитрацін | 528608 | 528600 | |||
| E-тест Бензилпеніцилін (висока концентрація) | 412263 | 502518 | |||
| E-тест Бензилпеніцилін (низька концентрація) | 412265 | 502618 | |||
| E-тест Ванкоміцин | 412488 | 525518 | |||
| E-тест Гатифлоксацин | 530218 | 530210 | |||
| E-тест Гентаміцин (висока концентрація) | 512708 | 512700 | |||
| E-тест Гентаміцин (низька концентрація) | 412368 | 512518 | |||
| E-тест Даптоміцин | 412324 | 535018 | 535010 | ||
| E-тест Доксициклін | 412328*** | 509718 | 509710 | ||
| E-тест Доріпенем | 412326*** | 535918 | 535910 | ||
| E-тест Іміпенем | 412374 | 513618 | |||
| E-тест Канаміцин | 527818 | 527810 | |||
| E-тест Кларитроміцин | 508718 | 508710 | |||
| E-тест Кліндаміцин | 412315 | 509518 | |||
| E-тест Колістін | 412317** | 537308 | 537300 | ||
| E-тест Левофлоксацин | 412393 | 527418 | |||
| E-тест Лінезолід | 412396 | 531318 | |||
| E-тест Меропенем | 412402 | 513818 | |||
| E-тест Метронідазол | 412404 | 530018 | |||
| E-тест Мецилінам | 513708 | 513700 | |||
| E-тест Міноциклін | 412409*** | 516018 | 516010 | ||
| E-тест Моксифлоксацин | 412411** | 529018 | 529010 | ||
| E-тест Мупіроцин | 412417*** | 413496 | 516300 | ||
| E-тест Налідіксова кислота | 516508 | 516500 | |||
| E-тест Нетілміцин | 517518 | 517510 | |||
| E-тест Нітрофурантоїн | 412426*** | 530408 | 530400 | ||
| E-тест Норфлоклацін | 412428** | 519508 | 519500 | ||
| E-тест Оксацилін | 412432 | 520518 | |||
| E-тест Офлоксацин | 519618 | 519610 | |||
| E-тест Піперацилін | 521518 | 521510 | |||
| E-тест Піперацилін/тазобактам (4мкг/мл) | 412434 | 521418 | |||
| E-тест Поліміксин | 533408 | 533400 | |||
| E-тест Ріфампіцин | 412450 | 526018 | 526010 | ||
| E-тест Спектиноміцин | 529218 | 529210 | |||
| E-тест Стрептоміцин | 412454 | 526808 | 526800 | ||
| E-тест Сульфаметоксазол | 534118 | 534110 | |||
| E-тест Тейкопланін | 412461 | 522018 | |||
| E-тест Тетрациклін | 412471 | 522518 | |||
| E-тест Тайгециклін | 412475 | 533518 | |||
| E-тест Тікарцилін/клавуланова кислота | 522618 | 522610 | |||
| E-тест Тобраміцин (висока концентрація) | 533108 | 533100 | |||
| E-тест Тобраміцин (низька концентрація) | 522718 | 522710 | |||
| E-тест Триметоприм | 523618 | 523610 | |||
| E-тест Триметоприм/сульфаметоксазол (1/16) | 412481 | 524418 | |||
| E-тест Фосфоміцин | 529108 | 529100 | |||
| E-тест Фузідієва кислота | 511518 | 511510 | |||
| E-тест Хінупрістін/дальфопрістін | 528718 | 528710 | |||
| E-тест Хлорамфенікол | 412309 | 507518 | 507510 | ||
| E-тест Цефаклор | 504518 | 504510 | |||
| E-тест Цефалотин | 412307 | 503518 | 503510 | ||
| E-тест Цефепім | 412273 | 505018 | 505010 | ||
| E-тест Цефіксім | 412275 | 529918 | 529910 | ||
| E-тест Цефокситин | 412285 | 506518 | 506510 | ||
| E-тест Цефоперазон/сульбактам (2/1) | 529318 | 529310 | |||
| E-тест Цефотаксим (висока концентрація) | 412279 | 505518 | |||
| E-тест Цефотаксим (низька концентрація) | 412281 | 505618 | |||
| E-тест Цефотетан | 506308 | 506300 | |||
| E-тест Цефпіром | 506408 | 506400 | |||
| E-тест Цефподоксім | 505818 | 505810 | |||
| E-тест Цефтазідім | 412293 | 506718 | |||
| E-тест Цефтаролін | 412291 | ||||
| E-тест Цефтизоксим | 527308 | 527300 | |||
| E-тест Цефтобіпрол | 412297 | ||||
| E-тест Цефтріаксон (висока концентрація) | 412301 | 506618 | 506700 | ||
| E-тест Цефтріаксон (низька концентрація) | 412303 | 507018 | 507000 | ||
| E-тест Цефуроксим | 506918 | 506910 | |||
| E-тест Ципрофлоксацин | 412311 | 508618 | |||
| E-тест Енрофлоксацин | 528908 | 528900 | |||
| E-тест Ерітроміцин | 412334 | 510518 | |||
| E-тест Ертапенем | 412332 | 531618 | 531610 | ||
| Номер за каталогу |
|||
| Індивідуальна упаковка |
Пластикова секційна упаковка (t° зберігання -20°С) |
||
| Найменування | 30 стрипів | 100 стрипів | 30 стрипів |
| Визначення полірезистентності | |||
| E-тест Цефотаксим / Цефотаксим + клавуланова кислота (4 мкг/мл) |
412336** | 532208 | 532200 |
| E-тест Цефтазидим / Цефтазидим + клавуланова кислота (4 мкг/мл) Призначений для визначення наявності ферментів бета-лактамаз розширеного спектру (БЛРС), що інгібуються клавулановою кислотою, у грамнегативних бактерій, у тому числі Klebsiella spp., Escherichia coli, Proteus mirabilis, інших представників сімейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aerugin |
412340** | 532508 | 532500 |
| E-тест Цефепім / Цефепім + клавуланова кислота (4 мкг/мл) Призначений для визначення наявності ферментів бета-лактамаз розширеного спектру (БЛРС), що інгібуються клавулановою кислотою, у грамнегативних бактерій, у тому числі Klebsiella spp., Escherichia coli, Proteus mirabilis, інших представників сімейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aerugin |
412338** | 534708 | 534700 |
| E-тест Іміпенем / Іміпенем + ЕДТА Призначений для визначення наявності ферментів метало-бета-лактамазу у грамнегативних бактерій, у тому числі Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. | 534208 | 534200 | |
| E-тест Ванкоміцин / Тейкопланін Призначений для визначення стійкості (або помірної стійкості) до грампозитивних глікопептидів бактерій, у тому числі Staphylococcus aureus, Enterococcus spp. |
537208 | 537200 | |
| E-тест Цефотетан / Цефотетан + клаксацилін Призначений для визначення наявності ферментів AmpC-бета-лактамаз у грамнегативних бактерій |
537108 | 537100 | |
У лекції розглянуто основні методи визначення чутливості in vitroмікроорганізмів до антимікробних препаратів (диско-дифузійний, Е-тестів, методи розведення). Відображено підходи до емпіричного та етіотропного призначення антибіотиків у клінічній практиці. Обговорено питання інтерпретації результатів визначення чутливості з клінічної та мікробіологічної точок зору.
В даний час у клінічній практиці існують два принципи призначення антибактеріальних препаратів: емпіричне та етіотропне. Емпіричне призначення антибіотиківзасноване на знаннях про природну чутливість бактерій, епідеміологічних даних про резистентність мікроорганізмів у регіоні або стаціонарі, а також результати контрольованих клінічних досліджень. Безперечною перевагою емпіричного призначення хіміопрепаратів є можливість швидкого початкутерапії. Крім того, за такого підходу виключаються витрати на проведення додаткових досліджень.
Однак при неефективності антибактеріальної терапії, при нозокоміальних інфекціях, коли важко припустити збудника і його чутливість до антибіотиків прагнуть проводити етіотропну терапію. Етіотропне призначення антибіотиківпередбачає як виділення збудника інфекції з клінічного матеріалу, а й визначення його чутливості до антибіотиків. Отримання коректних даних можливе лише за грамотного виконання всіх ланок бактеріологічного дослідження: від взяття клінічного матеріалу, транспортування їх у бактеріологічну лабораторію, ідентифікації збудника до визначення його чутливості до антибіотиків та інтерпретації отриманих результатів.
Друга причина, що обумовлює необхідність визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів – це отримання епідеміологічних даних про структуру резистентності збудників позалікарняних та нозокоміальних інфекцій. На практиці ці дані використовують при емпіричному призначенні антибіотиків, а також для формування лікарняних формулярів.
Методи визначення чутливості до антибіотиків
Методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків діляться на 2 групи: дифузійні та методи розведення.
При визначенні чутливості диско-дифузійним методом на поверхню агару в чашці Петрі наносять бактеріальну суспензію певної щільності (зазвичай еквівалентну стандарту каламутності 0,5 McFarland) і потім поміщають диски, що містять певну кількість антибіотика. Дифузія антибіотика в агар призводить до формування зони пригнічення мікроорганізмів зростання навколо дисків. Після інкубації чашок у термостаті при температурі 35 -37 про С протягом ночі враховують результат шляхом вимірювання діаметра зони навколо диска в міліметрах ().
Малюнок 1.Визначення чутливості мікроорганізмів диско-дифузійним методом.
Визначення чутливості мікроорганізму за допомогою Е-тесту проводиться аналогічно до тестування диско-дифузійним методом. Відмінність полягає в тому, що замість диска з антибіотиком використовують смужку Е-тесту, що містить градієнт концентрацій антибіотика від максимальної до мінімальної (). У місці перетину еліпсовидної зони пригнічення росту зі смужкою Е-тесту набувають значення мінімальної переважної концентрації (МПК).
Рисунок 2.Визначення чутливості мікроорганізмів за допомогою Е-тестів.
Безперечною перевагою дифузійних методів є простота тестування та доступність виконання у будь-якій бактеріологічній лабораторії. Однак з урахуванням високої вартості Е-тестів для рутинної роботи зазвичай використовують диско-дифузійний метод.
Методи розведеннязасновані на використанні подвійних послідовних розведень концентрацій антибіотика від максимальної до мінімальної (наприклад від 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, і т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл та 0,125 мкг/мл) . При цьому антибіотик у різних концентраціях вносять у рідке живильне середовище (бульйон) або в агар. Потім бактеріальну суспензію певної щільності, що відповідає стандарту мутності 0,5 MсFarland, поміщають у бульйон з антибіотиком або на поверхню агару в чашці. Після інкубації протягом ночі при температурі 35 -37 про С проводять облік отриманих результатів. Наявність зростання мікроорганізму в бульйоні (помутніння бульйону) або на поверхні агару свідчить про те, що дана концентрація антибіотика є недостатньою, щоб придушити його життєздатність. У міру збільшення концентрації антибіотика зростання мікроорганізму погіршується. Першу найменшу концентрацію антибіотика (із серії послідовних розведень), де візуально не визначається бактеріальне зростання прийнято вважати мінімальною переважною концентрацією (МПК). Вимірюється МПК мг/л або мкг/мл ().
Рисунок 3.Визначення значення МПК методом розведення в рідкому живильному середовищі.
Інтерпретація результатів визначення чутливості
На підставі кількісних даних (діаметра зони придушення зростання антибіотика або значення МПК) мікроорганізми поділяють на чутливі, помірно резистентні і резистентні (). Для розмежування цих трьох категорій чутливості (або резистентності) використовують так звані прикордонні концентрації(breakpoint) антибіотика (або прикордонні значення діаметра зони придушення зростання мікроорганізму).
Рисунок 4.Інтерпретація результатів визначення чутливості бактерій відповідно до значень МПК.
Прикордонні концентрації є незмінними величинами. Вони можуть переглядатися залежно від зміни чутливості популяції мікроорганізмів. Розробкою та переглядом критеріїв інтерпретації займаються провідні фахівці (хіміотерапевти та мікробіологи), що входять до спеціальних комітетів. Одним із них є Національний комітет з клінічних лабораторних стандартів США (National Committee for Clinical Laboratory Standards – NCCLS). В даний час стандарти NCCLS визнані у світі та використовуються як міжнародні для оцінки результатів визначення чутливості бактерій при багатоцентрових мікробіологічних та клінічних дослідженнях.
Існують два підходи до інтерпретації результатів визначення чутливості: мікробіологічний та клінічний. Мікробіологічна інтерпретація заснована на аналізі розподілу значень концентрацій антибіотика, що пригнічують життєздатність бактерій. Клінічна інтерпретація полягає в оцінці ефективності антибактеріальної терапії.
Чутливі мікроорганізми (susceptible)
Клінічно до чутливих відносять бактерії (з урахуванням параметрів, отриманих in vitro), якщо при лікуванні стандартними дозами антибіотика інфекцій, що викликаються цими мікроорганізмами, спостерігають добрий терапевтичний ефект.
За відсутності достовірної клінічної інформації підрозділ на категорії чутливості базується на сумісному обліку даних, отриманих in vitro, та фармакокінетики, тобто. на концентраціях антибіотика, досяжних у місці інфекції (або сироватці крові).
Резистентні мікроорганізми (resistant)
До резистентних (стійких) відносять бактерії, коли при лікуванні інфекції, викликаної цими мікроорганізмами, немає ефекту від терапії навіть за використання максимальних доз антибіотика. Такі мікроорганізми мають механізми резистентності.
Мікроорганізми з проміжною резистентністю (intermediate)
Клінічно проміжну резистентність у бактерій мають на увазі у разі, якщо інфекція, спричинена такими штамами, може мати різний терапевтичний результат. Однак лікування може бути успішним, якщо антибіотик використовується у дозуванні, що перевищує стандартну, або інфекція локалізується у місці, де антибактеріальний препарат накопичується у високих концентраціях.
З мікробіологічної точки зору до бактерій з проміжною резистентністю відносять субпопуляцію, що знаходиться відповідно до значень МПК або діаметра зон, між чутливими та резистентними мікроорганізмами. Іноді штами з проміжною резистентністю та резистентні бактерії поєднують в одну категорію резистентних мікроорганізмів.
Слід зазначити, що клінічна інтерпретація чутливості бактерій до антибіотиків є умовною, оскільки результат терапії який завжди залежить лише від активності антибактеріального препарату проти збудника. Клініцистам відомі випадки, коли за резистентності мікроорганізмів, за даними дослідження in vitro, отримували добрий клінічний ефект. І навпаки, за чутливості збудника може спостерігатися неефективність терапії.
У певних клінічних ситуаціях, коли недостатньо результатів дослідження чутливості звичайними методами визначають мінімальну бактерицидну концентрацію.
Мінімальна бактерицидна концентрація (МБК)- найменша концентрація антибіотика (мг/л або мкг/мл), що при дослідженні in vitroвикликає загибель 99,9% мікроорганізмів від вихідного рівня протягом певного періодучасу.
Значення МБК використовують при терапії антибіотиками, що мають бактеріостатичну дію, або за відсутності ефекту від антибактеріальної терапії у особливої категорії хворих. Іншими випадками для визначення МБК можуть бути, наприклад, бактеріальний ендокардит, остеомієліт або генералізовані інфекції у пацієнтів з імунодефіцитними станами.
На закінчення хотілося б відзначити, що на сьогоднішній день не існує методів, які б з абсолютною достовірністю прогнозувати клінічний ефект антибіотиків при лікуванні інфекційних хвороб. Однак, дані результатів визначення чутливості можуть бути хорошим орієнтиром клініцистам для вибору та корекції антибактеріальної терапії.
Таблиця 1.Критерії інтерпретації чутливості бактерій
Зміст теми "Методи визначення чутливості до антимікробних засобів. Побічні ефекти антибіотикотерапії.":Нові методи визначення чутливості бактерій до хіміопрепаратів. Автоматичні системи обліку результатів способу серійних розведень. Е-тест.
В даний час розроблені комп'ютеризовані системи, що автоматично проводять виділення бактерій із досліджуваних зразківі визначальні їх чутливість до різних ЛЗ. Їхня основна перевага - звільнення персоналу бактеріологічних лабораторій від великого обсягурутинних досліджень та чітка стандартизація отриманих результатів.
Широке поширення цих пристроїв у вітчизняній практиці обмежує їхню вартість. Серед доступніших методів найбільшого поширення знайшли система Alamarі Е-тест, що поєднують у собі переваги методу серійних розведень та методу дисків
Нові методи визначення чутливості бактерій до хіміопрепаратів. Автоматичні системиврахування результатів методу серійних розведень">
Автоматичні системи обліку результатів методу серійних розведень(наприклад, Baxter MicroScan AutoSCAN-4) - автоматизовані інкубаційні системи з вбудованими фотометрами, що нефелометрично реєструють зростання бактерій або його відсутність через 24 години після внесення мікроорганізмів в лунки мікропанелей. Принцип дії заснований на обліку різниці оптичної щільності середовища в лунках, де є зростання бактерій, та в лунках, де його немає. В даний час розроблені пристрої (наприклад VITEK), що дозволяють отримати результати вже через 4-10 год.
Система Alamarє панель з лунками, в кожну поміщені диски з фільтрувального паперу, що містять різні концентрації антимікробних препаратів і просочені індикатором Alamar Blue. Після внесення в лунку бактерій диск синіє, а при подальшому зростанні його забарвлення змінюється на рожеву. Порядок розміщення дисків у лунках відповідає подвійним серійним розведенням препарату. Остання лунка із синім диском, що передує лункам із порозовілими дисками, відповідає МІК препарату.
Е-тест[від англ. ellipse, еліпс, так як за наявності чутливості утворюється зона затримки зростання еліптичної форми] - модифікація методу дисків, але замість останніх використовують смужки з фільтрувального паперу, просоченого різними концентраціями препаратів, кожна з цих зон має відповідне маркування. Смужки поміщають на поверхню агару. Якщо бактерії чутливі до дії препарату, навколо ділянок смужки, що містять його інгібуючі концентрації, утворюється еліпсоподібна зона. Її форма обумовлена дією відразу кількох концентрацій препарату. МІК відповідає ділянка смужки, де її перетинає межа зони затримки зростання.
Е-тест (Etest) - добре продуманий метод визначення антибіотикочутливості в лабораторіях всього світу. Він широко застосовуються у вивченні резистентності як у діагностичних, так і у випробувальних клініках. Тест є кількісним методом визначення МІКпротигрибкових та антибактеріальних препаратів для інфекційних агентів, у тому числі септичних, що особливо важливо для тяжких хворих. У цьому методі зараз налічується 100 з лишком антибіотиків для тестування ряду аеробних бактерій і вибагливих організмів, таких як пневмококи, гемофільні мікроорганізми, H.pylori, менінгококи, гонококи, анаеробні, гриби та мікобактерії. Е-тестдає можливість раціонального використання антибіотиків, що забезпечують найкращий результат для пацієнтів, а також корекції схеми лікування після емпіричного призначення препаратів. Тест надзвичайно важливий для визначення дози антибіотика у пацієнтів з топографічно важкодоступною локалізацією вогнища інфекції (нр. ендокардит), при деяких внутрішньолікарняних інфекціях, хронічних інфекціях та у пацієнтів з імунодефіцитом.
Е-тест- Унікальна запатентована техніка. Його принцип полягає в тому, що на пластикову тест-смужку нанесені послідовні розведення антибіотика від меншого до більшого і дозволяє точно визначити щонайменше по 15-ти розведенням антимікробну активність бактеріальних агентів як вибагливих так і немає.
Процедура проведення тесту проста, стрип із реагентом кладеться на поверхню засіяного агару зі стандартного розведення. Після інкубації результат зчитується за нанесеною на пластинку шкалою розведень за місцем перетину зони затримки зростання, у вигляді еліпса, з тест-смужкою.
Е-тестмає ряд переваг у контролі резистентності, тому що він містить градієнт концентрацій, здатний показати найменші зміни чутливості. Ширина градієнта концентрацій цього тесту покриває варіації чутливо. 
сти мікроорганізмів і визначає як низький, і високий рівні резистентності.
Це найчутливіший тест на сьогодні. Е-тест— це макрометод, який можна легко впровадити в лабораторію визначення чутливості. В епоху відкриття нових інфекцій і зростаючої резистентності мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів, Е-тествизнаний у всьому світі як найважливіша інновація у визначенні антимікробної активності.
У каталозі Біомер'я 2013 року на стор. 33 - 36 представлений повний перелік Е-тестів (100 найменувань):
- Протибактеріальні
- Протигрибкові
- Протитуберкульозні
- На визначення полірезистентності
| Найменування | Кат. № | |
 |
протигрибковий |
20306 |
| 19364 | ||
 |
20307 | |
 |
20457 | |
 |
21040 | |
 |
21053 | |
 |
21055 | |
| 19361 | ||
| 19362 | ||
|
Упаковка з фольги містить картридж із пінного матеріалу з 30 стрипами та вологопоглинач; зберігати 2-8 ° С або при контрольованій кімн. t°С |
19363 | |
|
упаковка є блістером (пластикова секційна упаковка), що складається з 10 осередків, кожна з яких містить по 3 стрипи (протибактеріальні). Зберігання при -20°С |
19365 | |
|
Упаковка є блістером (пластикова секційна упаковка), що складається з 10 осередків, кожен осередок містить по 3 стрипи (протибактеріальні). Зберігання при -20°С |
19366 | |
|
Упаковка є блістером (пластикова секційна упаковка), що складається з 10 осередків, кожна з яких містить по 3 стрипи (протибактеріальні). Зберігання при -20°С |
19359 | |
|
Упаковка з фольги містить картридж із пінного матеріалу з 30 стрипами та вологопоглинач; зберігати 2-8 ° С або при контрольованій кімн. t°С |
19371 | |
|
Упаковка з фольги містить картридж із пінного матеріалу з 30 стрипами та вологопоглинач; зберігати 2-8 ° С або при контрольованій кімн. t°С |
19375 | |
|
Упаковка з фольги містить картридж із пінного матеріалу з 30 стрипами та вологопоглинач; зберігати 2-8 ° С або при контрольованій кімн. t°С |
19374 | |
|
Упаковка з фольги містить картридж із пінного матеріалу з 30 стрипами та вологопоглинач; зберігати 2-8 ° С або при контрольованій кімн. t°С |
19373 | |
|
Упаковка є блістером (пластикова секційна упаковка) з 10 осередків, кожен осередок містить по 3 стрипи (протибактеріальні). Зберігання при -20°С |
19372 | |
|
Упаковка є блістером (пластикова секційна упаковка) з 10 осередків, кожен осередок містить по 3 стрипи (протибактеріальні). Зберігання при -20°С |
19370 | |
 |
Упаковка з фольги містить картридж із пінного матеріалу з 30 стрипами та вологопоглинач; зберігання 2-8°З або контрольованої кімн. t°С |
19360 |
